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金属螯合介质(IDA)
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 一、产品简介

产品名称:金属螯合介质(IDA

产品介绍金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC)。该法利用蛋白质表面的某些氨基酸(如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等)和金属离子(Cu2+、Zn2+、Ni2+等过渡金属离子)发生特殊的相互作用的原理,从而实现蛋白质的分离。金属螯合高流速琼脂糖介质(Ni-IDA QZT 6FF)是将亚氨基二乙酸(IDA)键合在高流速琼脂糖微球上,并螯合金属离子Ni2+而形成的一种亲和层析介质。影响蛋白质/多肽与金属离子鳌合力大小的因素主要是蛋白质表面可结合的氨基酸(种类、数目和分布)、金属离子的种类和密度、层析条件(pH、盐的种类和浓度、添加剂等)。IMAC具有吸附容量大、选择性好、分辨率高、易于再生、成本较低等优点,广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的分离纯化,尤其是组氨酸标记蛋白质的分离纯化。

二、产品特性

Ni-IDA QZT 6FF亲和介质具有良好的稳定性、生物相容性和溶剂相容性,这不仅有利于保持产品的生物活性和提高产品的收率,还有利于扩大层析操作条件的选择范围。Ni-IDA QZT 6FF亲和介质的理化性质和溶剂相容性分别如表1和表2所示。

表1. Ni-IDA QZT 6FF的理化性质及特征参数

参数

指标

基质

6%交联琼脂糖凝胶

配基

-N(CH2COOH)2   (IDA)

形状

球形

平均粒径

90 μm (45-165)

金属离子密度

~40 μmol Ni2+/ml wet gel

动态载量a

~25-30 mg His-Tagged LDH/ml wet gel

推荐流速b

5-10 ml/min   (150-300 cm/h)

最高流速b

20 ml/min (600   cm/h)

最高耐压b

0.3 MPa (3 bar)

化学稳定性c

 

0.01    M HCl0.1    M NaOH37 °C, 7天);1 M NaOH70%乙酸(12   h);30%异丙醇(30 min);2% SDS1 h

避免使用的试剂

螯合剂,如EDTAEGTA、柠檬酸等

pH稳定性c

2-14(短期,2 h);3-12(长期,7天)

储存条件

20%乙醇,4-30 oC

动态载量a:

样品:平衡缓冲液中含1mg/ml histidine-tagged LDH(Mr 140000);

计算方法:根据10%穿透点计算介质动态载量(QB, 10%);

柱体积:5 ml(6.37*1.0 cm I.D.);

流速:2.5 ml/min;

平衡缓冲液:20mM PB + 0.1M NaCl + 50 mM 咪唑, pH 7.4;

洗脱缓冲液:20mM PB + 0.1M NaCl + 0.5 M 咪唑, pH 7.4;

注意:动态载量与蛋白种类和操作条件密切相关。

b:流动相为纯水,室温下操作,柱尺寸为10.0*1.6 cm I.D.,CV=20.0 ml。

c:未螯合Ni2+的介质。

表2  Ni-IDA QZT 6FF和特定浓度试剂的相容性

试剂类型

试剂名称及浓度

还原试剂

10 mM β-巯基乙醇

变性剂

8 M 尿素、6 M 盐酸胍

去污剂

2%Triton X-1002%Tween-202%NP-402%胆酸盐、1%CHAPS

缓冲液组分

50 mM 磷酸钠, pH7.4100 mM Tris-HClpH7.4100 mM   Tris-acetate, pH7.4100 mM HEPESpH7.4100 mM MOPSpH7.4100 mM 醋酸钠,pH7.4

其它试剂

20%乙醇、50%甘油、0.1 M Na2SO41.5 M NaCl1 mM EDTA60 mM 醋酸

 

 

 

三、产品应用

Ni-IDA QZT 6FF广泛用于蛋白质、核酸及多肽,尤其是组氨酸标记蛋白质的分离纯化。金属螯合层析可采用重力柱、蠕动泵和层析系统等模式进行操作。以层析系统操作模式为例,层析操作通常包括装柱、螯合金属离子、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤(具体操作条件以10.0 * 1.6 cm I.D.,CV=20.0 ml层析柱为例)。

3.1 装柱

(1)Ni-IDA QZT 6FF介质通常在4 oC下保存于20%乙醇中,使用前先取出适量(22 ml介质)介质放置于烧杯中,用纯水置换掉20%的乙醇溶液,静置沉降后倒掉部分上清至凝胶浓度约为60%(匀浆液体积约为36 ml),搅拌均匀后备用(匀浆液温度尽量接近室温)。

(2)清洗层析柱及配件,排气泡后拧紧层析柱底端的出口,加入适量纯水至0.2-0.5 cm液位高度。

(3)用玻璃棒将介质匀浆液轻轻搅拌均匀(避免引入气泡),然后用玻璃棒导流将匀浆液沿着柱内壁一次性倒入柱内,尽量避免产生气泡。介质在层析柱内自由沉降后(30 min),连结好柱子顶端柱头(预先去除管道内及接口处的气泡)。

(4)打开泵,先用纯水以2.5 ml/min的流速压柱(10 min至胶面),然后再以4ml/min的流速压柱,使柱床稳定,调节顶端柱头至胶面处。用2~3倍柱体积(CV)的缓冲液平衡柱子。

表3 推荐装柱流速

层析柱

装柱流速(ml/min

最高使用流速(ml/min

第一步

第二步

20 mm×10 mm   I.D.

0.9

4.7

2

20 mm×16mm I.D.

2.5

8.7

5

20 mm×26 mm   I.D.

6.6

23

13

20 mm×50 mm   I.D.

24.5

85

49

3.2 螯合金属离子

    本介质可以根据需要,螯合不同的金属离子,如Cu2+、Ni2+或Zn2+等。Cu2+与蛋白质结合最强,Ni2+与蛋白质结合适中,Zn2+与蛋白质结合最弱,可根据实际需要选择。用户可选择购买螯合了相应金属离子的介质(出厂时一般以螯合Ni2+的形式提供,此时无需螯合金属离子步骤),也可自行螯合。

具体的鳌合方法如下:

(1)层析柱(未螯合或再生后)用5CV的纯水清洗(5 ml/min,下同);    

(2)选择合适的金属离子(Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe3+等),溶解在中性或弱酸性溶液中,浓度为用0.2 mol/L,过滤后使用,其中Fe3+必须在低pH(3.0)下鳌合,以防止Fe3+产生沉淀;

(3)用5 CV的金属离子溶液上柱,鳌合金&l

 

电话:0519-82663391
邮箱:sales@wowmaterials.com

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