一、产品简介

产品名称：聚苯乙烯氨基磁珠

产品描述：

Homo-NH2均匀的、单分散的表面具-NH2官能团的超顺磁微粒，由Fe3O4核和GMA涂层组成。通过GMA修饰，-NH2基团通过短的亲水性连接臂连接到磁珠上。亲水表面确保磁珠在各种缓冲液中具有出色的分散性和易操作性。表面具有反应性胺基的磁珠允许配体如蛋白质、肽、碳水化合物或其它特异性分子的固定。配体的固定可通过醛或酮的还原胺化而不预先活化磁珠表面。或者，EDC交联剂可用于羧基将配体与胺偶联。最后，胺反应性双功能交联剂用于引入其它官能团以偶联配体。

 Homo-NH2可以用肽、酶、碳水化合物等包被以分离不同的靶标，如激素、受体、凝集素、疾病标志物、噬菌体。一旦与配体结合后，将磁珠加到含目标分子的样品中，短时间孵育后，可通过磁珠亲和捕获靶标。磁分离可除去不需要的上清液，洗涤目标结合的磁珠以得到纯样品。磁珠结合的靶标可直接用于生物测定，并在SDS-PAGE上分析。用常规洗脱方法可将目标分子从磁珠上洗脱下来。

 

二、产品方案

方案1. 用于连接醛和酮

含有醛和酮的配体可通过形成Schiff's碱与氨基磁珠偶联，并用氰基硼氢化钠还原胺化。醛基可通过高碘酸钠氧化糖蛋白中的糖残基或多糖中相邻羟基的C-C键的裂解而容易地制备。

 

缓冲液

·  偶联缓冲液 Coupling Buffer (0.1M sodium phosphate, 0.15M NaCl or 100mM sodium borate, pH9.5 or 100mM sodium citrate, pH9.5);

5M Sodium Cyanoborohydride in 1M NaOH;

0.1M Ethanolamine, pH7.4;

 

清洗氨基磁珠

1. 彻底重悬氨基磁珠并转移足量磁珠到干净EP管中。磁分离，并吸弃上清液。从磁力架上取下EP管，加入200μl偶联缓冲液重悬磁珠。磁分离，并吸弃上清液。

2. 用上述缓冲液清洗两次。

 

配体的结合

1. 将配体溶解偶联缓冲液中至浓度1-10 mg/ml。

2. 将适量的配体加入洗过的氨基磁珠并混匀。

3. 每100μl反应混合物中加入1μl的5M氰基硼氢化钠（溶于1M NaOH溶液），室温下孵育2小时。磁分离，并吸弃上清液。

4. 加入反应混合物同体积的0.1M乙醇胺，并在室温下旋转孵育15分钟。磁分离，吸弃上清液。

5. 加入适量的PBS并混匀磁珠。磁分离，吸弃上清液。

6. 重复步骤5两次。

 

方案2. 用NHS交联剂活化

最常见的一类活化剂是NH。根据交联剂的性质，可与待固定的配体中的化学基团反应，包括胺、巯基、羧基和羟基以及非选择性光反应。NHS交联剂通常必须在使用前新配。与待固定的配体量相比，使用10倍摩尔过量。

缓冲液

偶联缓冲液Coupling Buffer (0.1 M sodium phosphate buffer with 0.15 M NaCl, pH 7.4);

0.05 M Tris, pH 7;

 

清洗氨基磁珠

1. 彻底重悬氨基磁珠并转移足量磁珠到干净EP管中。磁分离，并吸弃上清液。从磁力架上取下EP管，加入200μl偶联缓冲液重悬磁珠。磁分离，并吸弃上清液。

2. 用上述缓冲液清洗两次。

 

氨基磁珠的活化

1.        用偶联缓冲液重悬氨基磁珠。

注意：避免含有氨基的缓冲液如Tris或甘氨酸，因为它们会与NHS反应竞争。

2. 根据说明溶解NHS，并将所需体积加入磁珠，混匀。可将水溶性NHS直接加入磁珠中。终体积应等于瓶中最初的液体体积。

3. 室温孵育30min。磁分离，吸弃上清。用上述缓冲液洗两次。

4. 磁珠活化完成。

 

方案2-1. 用-NH2反应性的NHS-酯交联剂活化后偶联

使用同双功能交联剂时，第二个NHS-酯基团将与配体中的-NH2反应，因此通常用于固定肽或蛋白质的N-末端。步骤如下：

1. 重新悬浮活化的氨基磁珠。使用相同的缓冲液将体积调整到所需的磁珠浓度。

2. 加入计算后一定量的配体，混匀。

3. 室温下孵育30分钟或4°C下缓慢倾斜旋转2小时。

4. 孵育后，将试管置于磁铁上2分钟，取出上清液。

5. 加入0.05M 的Tris（pH7）并在室温下温育15分钟以猝灭未反应的活性氨基。

6.用偶联缓冲液洗涤磁珠两次。

 

方案2-2. 用-SH反应性的NHS-酯交联剂活化后偶联

巯基活性基团通常是吡啶二硫基或碘代/溴代乙酰基。寡核苷酸也可使用马来酰亚胺。适当的缓冲液和孵育条件与巯基反应，配体须含待固定的游离巯基。

1. 重新悬浮活化的磁珠。根据所选的巯基反应基团使用缓冲液（请参见下表）。使用相同的缓冲液将体积调整到所需的磁珠/配体浓度。

2. 加入计算量的游离巯基配体，涡旋混匀。

3. 按下表推荐的时间和温度孵育。

4. 孵育后，可加入半胱氨酸至终浓度为5mM以淬灭未反应基团。室温下孵育15分钟。

5. 如所述洗涤偶联的磁珠。

方案2-3. 用光反应性的NHS-酯交联剂活化后偶联

光反应基团如羟苯基叠氮化物、硝基苯叠氮化物、苯叠氮化物或全氟芳基叠氮化物等可与胺基反应。带有光反应基团的交联剂的活化必须在暗室条件下进行。

1.  重新悬浮活化的氨基磁珠。根据活性基团选择缓冲液。用相同缓冲液将体积调整到所需的磁珠/配体浓度。

2.  加入计算后一定量的配体，混匀。

3.  使用推荐的时间、温度、适当波长的光照射。

注意：磁珠可能会熄灭光，因此须优化。

3.        将偶联的磁洗两次。

注意：磁珠与DMF等有机溶剂相容，上述活化和偶联均可在干燥有机溶剂中进行。这将消除竞争性水解反应，因此通过延长反应时间可获得更高产率。将磁珠从有机溶剂移至缓冲液之前，用纯水洗涤一次。

 

方案3. 用具有胺和羧基反应性的交联剂活化，以偶联含羧基的配体

在配体中不存在其他伯氨基的条件下，可通过使用EDC或EDC / NHS（或其它碳二亚胺）将磁珠表面的胺基和配体中的羧基连接在一起。 EDC与羧基反应形成胺反应性中间体，该中间体在水溶液中不稳定。为了稳定，可引入NHS。

 

缓冲液

偶联缓冲液Coupling Buffer (0.1 M MES, 0.5 M NaCl, pH 6.0);

注意：对于使用EDC的偶联反应，避免使用含游离胺或磷酸盐的缓冲液，因为这会干扰偶联效率。Tris，乙酸盐和甘氨酸缓冲液都易与EDC或偶联中间体反应。还应避免含硫醇缓冲液，因为它们不可逆地结合EDC并抑制偶联。

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC);

Sulfo-NHS or N-hydroxysuccinimide (NHS);

封闭缓冲液Quenching Buffer (50mM Tris, pH 8.0 or 5-10mM Hydroxylamine);

PBS;

 

偶联羧基配体

1.          偶联缓冲液0.1 M MES (2-[N-morpholino] ethane sulfonic acid), pH 4.5–5 (or 0.1 M MES, 0.5 M NaCl pH 6.0) 洗涤磁珠。将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

2.          将配体溶解在上述偶联缓冲液中至1–10 mg / mL的浓度，并加入推荐量的配体至上述磁珠，移液器吹打混匀。

3.          将10 mg EDC溶于1 mL冷去离子水中（或每mL溶解10 mg EDC和15 mg NHS）。

4.          注：EDC溶液和NHS溶液应新配，避光保存在冰上。

5.          每毫克配体，添加50–100μL的EDC（或EDC / NHS）溶液并涡旋。

6.          在室温下孵育2h，或在4°C下缓慢倾斜旋转孵育2h。

 

封闭磁珠

1.        加入500μl封闭缓冲液并重悬磁珠。室温孵育30分钟。

2.        将EP管置于磁力架上60秒，并吸弃上清液。

3.        加入500μl封闭缓冲液重悬磁珠。磁分离，吸弃上清。

4.        加入500μL的PBS（pH7.4）重悬磁珠。将EP管置于磁力架60秒，并吸弃上清液。重复洗涤2次。

5.        加入100μL的 PBS（pH7.4），重悬磁珠，4°C储存。

 

 

附录1：

A．免疫共沉淀分析

1. 将至少100μl含有靶抗原的细胞裂解物样品加入到来自步骤6的磁珠管中并涡旋10秒。

2. 室温孵育30分钟或4°C过夜，轻轻摇动。磁分离，弃上清。从磁力架上取下试管，加入200μl洗涤液重悬磁珠。磁分离，弃上清液，从磁力架上取下EP管。再洗两次去除未结合抗原。

3. 采用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析，加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液并在95°C加热磁珠5分钟。将磁珠/上样缓冲液混合物直接加到SDS-PAGE凝胶上，并按正常进行电泳和印迹。

 

B．抗体和抗原的排除：向磁珠、抗体、抗原混合物中加20μl洗脱液重悬磁珠。室温下孵育2min。磁分离，收集上清液到新EP管，加入2μl中和缓冲液（如1M Tris-HCl，pH8.5）调pH。